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            細菌氫ATP酶活性酶連續反應光譜法定量檢測試劑盒 產品說明書

            更新時間:2023-04-06 點擊次數:534

            主要用途

             細菌氫ATP酶(H-ATPase)活性酶連續反應光譜法定量檢測試劑是一種旨在使用ATP酶、丙酮酸激酶和乳酸脫氫酶連續循環法反應系統,排除其它ATP酶干擾的情況下,受到ATP酶的水解產生的ADP過程中,伴隨的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸NADH)的氧化反應, 即采用光譜法測定其氧化后吸光峰值(NADH濃度的變化,以此進行測算單位酶活性的而經典的技術方法。該技術經過精心研制、成功實驗證明的。其適合于各種細菌細胞H-ATP的特異性活性檢測。產品不含污染性蛋白酶,嚴格無菌,即到即用,操作簡捷,性能穩定,反應優化,檢測敏感。

            產品內容

            裂解液(Reagent A)           毫升

            保存液(Reagent B          毫升

            緩沖液(Reagent C         毫升

            酶促液(Reagent D             微升

            反應液(Reagent E             毫升

            底物液(Reagent F           毫升

            陰性液(Reagent G            毫升

            產品說明書                1

            保存方式

            保存在-20冰箱里,避免反復凍融;底物液(Reagent F),避免光照,有效保證6

            用戶自備

            15毫升錐形離心管:用于樣品操作的容器

            1.5毫升離心管:用于樣品操作和保存的容器

            (微型)臺式離心機:用于樣品操作

            恒溫搖床:用于細菌培養

            培養箱:用于反應孵育

            比色皿:用于光譜分析的容器

            分光光度儀:用于光譜分析

            實驗步驟 

            實驗開始前,將-20℃冰箱里的試劑盒中的試劑溶液置入冰槽里融化;底物液(Reagent F注意避光。然后進行下列操作。

            一、 樣品準備

            1. 準備好10毫升待測的細菌放進37搖床孵育16小時,速度為220RPM

            2. 直至OD6000.40.8,即12 X 107細胞/毫升

            3. 置于冰槽里5分鐘

            4. 放進4℃臺式離心機離心5分鐘,速度為1000g

            5. 小心抽去上清液

            6. 加入xx微升裂解液(Reagent A,充分混勻

            7. 轉移到預冷的1.5毫升離心管

            8. 強力渦旋震蕩15

            9. 置于冰槽里30分鐘,期間強力渦旋震蕩15三次

            10. 放進4℃微型臺式離心機離心10分鐘,速度為300g(或1000RPM,例如eppendorf 5415

            11. 小心移取500微升上清液到新的預冷的1.5毫升離心管

            12. 放進4℃微型臺式離心機離心15分鐘,速度為16000g(或13000RPM,例如eppendorf 5415

            13. 小心去掉上清液 

            14. 加入xx微升保存液(Reagent B,混勻

            15. 移取10微升進行蛋白定量檢測(注意:建議使用 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒-GMS30030.1

            16. 即刻放進-70℃保存或置于冰槽里繼續后續操作 

            二、測定準備

            1. 準備好待測樣品(例如純化細菌細胞膜蛋白等),置于冰槽里 

            2. 設定好分光光度儀(溫度為37℃):波長為340nm,間隔5分鐘,讀數7次(共30分鐘),并置零

            3. 緩沖液(Reagent C室溫下均衡溫度

            三、背景對照測定

            1.移取xx微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿

            2.加入xx微升酶促液(Reagent D)

            3.加入xx微升反應液(Reagent E)

            4.加入xx微升底物液(Reagent F)

            5.放進37℃培養箱里靜置3分鐘

            6.加入xx微升陰性液(Reagent G)

            7.上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)

            8.即刻放進分光光度儀檢測,此為背景空對照:340波長讀數0分鐘 -340波長讀數30分鐘

            四、樣品活性測定

            1.移取xx微升緩沖液(Reagent C)到新的比色皿

            2.加入xx微升酶促液(Reagent D)

            3.加入xx微升反應液(Reagent E)

            4.加入xx微升底物液(Reagent F)

            5.放進37℃培養箱里靜置3分鐘

            6.加入50微升待測樣品(注意:50微克膜蛋白;樣品須溶解)

            7.上下傾倒數次,混勻(限定在3秒之內)

            8.即刻放進分光光度儀檢測,此為樣品總活性讀數:340波長讀數0分鐘 -340波長讀數30分鐘

            五、計算樣品活性

            注意事項

            1.本產品為21次操作,包括背景對照測定

            2.操作時,須戴手套

            3.系統操作過程中,背景測定只需1次

            4.建議樣品忌用磷酸緩沖溶液、鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、EDTA、EGTA等,可以使用SUCROSE、IMIDAZOLE等  

            5.加入樣品啟動反應后3秒內即刻光譜測定

            6.反應測定值由高到低變化;測定可以持續30分鐘

            7.測定值由高到低變化,即0分鐘測定讀數高于10分鐘或30分鐘測定讀數,表明有酶活性

            8.光譜測定后,比色皿須清洗充分

            9.建議待測樣本膜蛋白濃度為50微克/50微升;如果樣本酶活性過低或過高,則可以增加或降低樣本量;注意計算公式的調整(本公司提供 Bradford蛋白質濃度定量試劑盒GMS30030.1)

            10.樣品特異活性是指排除其它,包括鈣(EGTA處理)、鈉鉀(烏本苷;ouabain處理)等ATP酶的干擾后的氫ATP酶活性

            11.氫ATP酶活性單位濃度定義:在37℃溫度下,pH 7.5條件下,每分鐘內能夠氧化1微摩爾還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)所需的酶量作為一個活性單位

            12.本公司提供系列ATP酶類分析技術產品 

            質量標準

            1. 本產品經鑒定性能穩定

            2. 本產品經鑒定檢測準確


            聯系方式

            郵件:jskangchina@163.com
            地址:山東青島市青大工業園韓海路
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